Ако някога сте прекарвали време в анализиране на диапозитиви с дигитална патология или образни изследователски проби, вероятно сте се чудили как скенер за микроскопски слайдове улавя всеки детайл с такава прецизност – дори когато слайдът има фини вариации във височината или малки несъвършенства, които биха изместили фокуса на стандартна камера. Като доставчик на високопроизводителни цифрови скенери за диапозитиви, получавам този въпрос през цялото време и това е една от най-критичните части за това защо нашето оборудване осигурява надеждни, последователни резултати ден след ден. Нека да разберем как точно работи механизмът за фокусиране, защо има значение за различни случаи на употреба и как нашите скенери са проектирани да превъзхождат в тази област.
Първо, нека започнем с основите: предметните стъкла за микроскоп не са идеално плоски. Стандартното предметно стъкло е с дебелина около 1 мм, но върху него се монтират биологични проби (като тъканни срезове, клетъчни култури или цитологични препарати) и тяхната височина може да варира от 10 до 50 микрона — понякога повече, в зависимост от това как е приготвена пробата. Дори малък прах или отломки върху слайда добавят малки, неочаквани слоеве. За да може скенерът да заснеме ясно изображение, неговият фокус трябва да се регулира непрекъснато, докато се движи през слайда, и трябва да прави това по-бързо, отколкото човешкото око може да мигне, като същевременно поддържа точност в рамките на част от микрона. Това не е малко.
Повечето скенери за микроскопски предметни стъкла използват една от двете основни технологии за фокусиране: пасивен автофокус (AF) или активен AF, а много модели от висок клас комбинират и двете, за да получат най-доброто от двата свята. Нека започнем с пасивен AF, защото това е, което вградихме в нашите базови скенери за светло поле като Brightfield Slide Scanner EScan-1200. Пасивният AF не излъчва външен сигнал; вместо това анализира светлината, отразена от слайда, за да определи къде е най-отчетливият фокус. Софтуерът на системата разглежда контраста на изображението през малки прозорци, докато скенерът движи обектива нагоре и надолу. Когато контрастът е най-висок, това е точката на остър фокус. За приложения със светло поле, където пробите се оцветяват с багрила, които създават отчетливи светло-тъмни разлики, това работи много добре. Достатъчно бърз е за сканиране на диапозитиви в светло поле при 20x или 40x увеличение и поддържа по-ниски разходи за лаборатории, които не се нуждаят от флуоресцентни изображения. Но пасивният AF има своите граници – ако слайд има много равномерна област с нисък контраст (като прозрачен стъклен ръб или тънък, неоцветен образец), софтуерът не може да улови разликите в контраста и фокусът може да се отклони.
Тук се намесва активният AF и това е технологията, която даваме като приоритет за скенери от изследователски клас, като нашия флуоресцентен скенер за слайдове от изследователски клас. Активният AF използва отделен сензор или източник на светлина, за да проектира сигнал върху слайда, след което измерва как този сигнал се отразява обратно, за да изчисли точното разстояние от обектива до образеца. Двата най-често срещани типа активен AF, използвани в скенери за слайдове, са лазерна триангулация и фокусиране, базирано на хроматични аберации. Лазерната триангулация е по-проста: инфрачервен лазерен лъч с ниска мощност се насочва към слайда и сензор на камерата открива къде попада лазерното петно върху слайда. Ако слайдът е твърде близо или твърде далеч, петното се премества върху сензора и скенерът коригира позицията на лещата, за да върне петното обратно в идеалната точка. Това работи дори при проби с нисък контраст, защото измерва физическо разстояние, а не светлинен контраст. Фокусирането с хроматична аберация използва източник на светлина, който се разделя на различни дължини на цветните вълни; всяка дължина на вълната фокусира на малко по-различно разстояние, така че скенерът сравнява как всеки цвят се отразява от слайда, за да изчисли фокуса. Това е особено полезно за флуоресцентни слайдове, които могат да имат дори по-нисък контраст от пробите със светло поле, тъй като флуорофорите излъчват светлина, вместо да я отразяват.
Много от нашите скенери, като Digital Pathology Slide Scanner, използват хибридна AF система, която комбинира пасивен и активен AF за премахване на слепите петна. Ето как работи: когато скенерът за първи път зареди слайд, той използва активен AF, за да картографира профила на височината на целия слайд в рамките на първите 10 секунди. Това създава „топографска карта“ на слайда, маркирайки всяка неравност, спад и вариация. След това, докато скенерът се движи през слайда, заснемайки изображения, той използва пасивен AF, за да регулира бързо фокуса за всяко отделно зрително поле, като използва предварително заредената карта само когато срещне области, където пасивният AF би се затруднил. Този хибриден подход съкращава времето за сканиране, като същевременно гарантира, че дори трудни проби, като вградени в парафин тъканни стъкла с дебели, неравни участъци, остават на фокус в цялото изображение.
Друга ключова част от механизма за фокусиране е пиезо моторът, който всъщност движи обектива или сцената, за да регулира фокуса. Пиезо моторите се използват вместо стандартните стъпкови двигатели, защото са по-бързи и по-прецизни: те могат да регулират позицията за наносекунди, с точност до 10 нанометра - много по-малък от най-малкия детайл върху тъканна проба. За сканиране с голямо увеличение (като 60x или 100x, което е често срещано в изследователската патология), тази прецизност не подлежи на обсъждане. Ако фокусът е изместен дори с 0,5 микрона, изображението ще бъде размазано и ще пропуснете малки структури като ядра или протеинови маркери. Нашият многоканален флуоресцентен слайд скенер използва пиезомоторна система, която може да прави над 1000 корекции на фокуса в секунда, което означава, че може да сканира 40x флуоресцентен слайд за половината време от скенер със стъпков двигател, без да губи острота.
Чакай, но какво да кажем за случаите, когато пробите са дебели? Някои биологични проби, като диапозитиви от цели организми или 3D клетъчни култури, са с дебелина десетки микрони, така че дори един слой не може да улови всички детайли. Това е мястото, където функцията Z-подреждане на нашите скенери, която се свързва директно с механизма за фокусиране, се намесва. Вместо да фокусира веднъж на зрително поле, скенерът улавя 3 до 5 изображения в различни равнини на фокусиране, след което ги съединява, за да създаде единично фокусирано изображение, което включва всеки слой от пробата. За изследователски приложения това е от съществено значение за изучаване на 3D структурата на тъканите или съвместно локализиране на множество флуоресцентни маркери. Нашият дигитален скенер за патология GScan-60 има режим на Z-подреждане, който настройва фокуса на стъпки от 2 микрона, така че да не пропуснете нито един детайл в дебелите клинични проби.
Виждал съм от първа ръка как лошото фокусиране може да провали изследователската или диагностичната работа на лабораторията. Мой колега от малка лаборатория по патология веднъж ми каза, че използват по-евтин скенер за слайдове, който губи фокус върху краищата на слайдовете, принуждавайки техните патолози да коригират ръчно 20% от изображенията. Това губи часове време и води до забавяне на диагнозите на пациентите. Когато преминаха към нашите скенери, хибридната AF система намали ръчните настройки до по-малко от 1%, а времето за сканиране спадна с 30%. Това е истинската стойност на добре проектирания механизъм за фокусиране – не става дума само за получаване на ясно изображение; става въпрос за спестяване на време, намаляване на човешката грешка и позволяване на по-точни резултати.
Има няколко често срещани мита относно фокусирането на скенера за слайдове, които също искам да изясня. Някои хора смятат, че по-голямото увеличение означава, че се нуждаете от по-сложна система за фокусиране, но това е по-малко за увеличението и повече за типа на пробата. Например, 40x диапозитив в ярко поле на оцветена тъканна проба се нуждае от прецизен фокус, но 20x слайд от клетъчни култури върху плоско стъкло може да работи добре с пасивен AF. Други митове: че активният AF винаги е по-бавен от пасивния AF. С модерните пиезо мотори активният AF всъщност е по-бърз, защото не е необходимо да сканира множество позиции, за да намери най-резкия контраст - той изчислява разстоянието директно.
Друг важен фактор при фокусирането е калибрирането. Дори и най-добрият механизъм за фокусиране няма да работи, ако не се калибрира редовно. Нашите скенери се доставят с рутинни процедури за автоматично калибриране, които се изпълняват всеки път, когато заредите нов тип слайд, и ние предоставяме ръководства стъпка по стъпка за ръчно калибриране, ако е необходимо. Ние също така включваме тестови слайдове с всеки скенер, така че лабораториите да могат да проверят дали фокусът е точен. За изследователски настройки, където последователността между експериментите е от ключово значение, това калибриране гарантира, че изображенията от различни сканирания са сравними, дори с месеци.
Сега нека поговорим за това как проектираме нашите механизми за фокусиране, за да отговарят на различните нужди на клиентите. Изследователска лаборатория, която сканира флуоресцентни слайдове, се нуждае от система за фокусиране, която може да обработва множество флуорофори, които могат да имат различни дължини на вълните на излъчване. Нашият изследователски флуоресцентен слайд скенер е проектиран със сензор, който отчита различни дължини на светлинните вълни, така че фокусът остава постоянен, независимо дали сканирате DAPI (син), FITC (зелен) или Texas Red (червен) канали. За лабораториите по дигитална патология, които обработват стотици слайдове на ден, скоростта е от решаващо значение – нашата хибридна AF система на GScan-60 може да сканира цял слайд за по-малко от 5 минути, а механизмът за фокусиране не става по-малко прецизен при хиляди сканирания, защото използваме издръжливи компоненти от промишлен клас.
Също така имах клиенти да питат за фокусиране върху мокри слайдове, като слайдове за изображения на живи клетки. Нашите скенери могат да се справят с мокри слайдове, но препоръчваме да използвате активен AF режим, тъй като мокрите проби могат да имат повърхностни отражения, които объркват пасивния AF. Лазерно базираният активен AF може да проникне през тънкия течен слой на предметното стъкло, за да се фокусира върху самата проба, което е голямо предимство за лабораториите, които правят изображения с изтичане на времето на клетъчни култури.
В края на деня фокусиращият механизъм е невъзпятият герой на скенера за микроскопски предметни стъкла. Това е частта, която работи зад кулисите, за да превърне размазано стъкло в ясно, детайлно цифрово изображение, което изследователите могат да анализират, патолозите могат да използват, за да поставят диагнози, а клиницистите могат да разчитат на планове за лечение. Независимо дали управлявате малка диагностична лаборатория, университетска изследователска лаборатория или фармацевтична компания, тестваща нови лекарства, надеждната система за фокусиране не е лукс – тя е необходимост.
Ако търсите скенер за предметни стъкла за микроскоп и искате да научите повече за това как нашата технология за фокусиране може да отговаря на вашите нужди, нашият екип е тук, за да ви помогне. От скенери със светло поле за рутинна диагностика до флуоресцентни скенери от изследователски клас за усъвършенствани изображения, можем да ви преведем през функциите, които са най-важни за вашата работа. Независимо дали се интересувате от EScan-1200 за вашата патологична лаборатория, GScan-60 за високопроизводително сканиране или нашите многоканални флуоресцентни скенери за вашите изследвания, ние сме готови да обсъдим как нашето оборудване може да рационализира вашия работен процес и да подобри вашите резултати.
Референции
- Агравал, М. и Гупта, Р. (2021). Технологии за автоматично фокусиране за скенери за цифрови патологични слайдове: сравнителен анализ. Journal of Pathology Informatics, 12 (1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020 г.). Механизми за високо прецизно фокусиране за системи за изображения на цял слайд. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39 (8), 2678-2687.
- Световна здравна организация. (2019 г.). Дигитална патология за диагностични и изследователски приложения: Технически спецификации и най-добри практики. WHO Press, Женева.
