Ако някога сте прекарвали часове в наблюдение на живи клетки – наблюдавайки ги как се делят, реагират на лекарства или мигрират в реално време – знаете, че празнината между необработените данни и прозренията, които могат да действат, често се свежда до това какво може да направи вашата система извън основната си настройка. Като доставчик на системи за изображения на живи клетки, аз разговарям с изследователи всяка седмица, които използват недостатъчно оборудването си, защото не знаят надстройките, които превръщат добрия апарат за изображения в гъвкав, високопроизводителен инструмент, пригоден за тяхната работа. Нека разбием надстройките, които правят най-голямата разлика, от достъпност за научни работници до прецизност за специализирани изследвания.
Първо, важно е да започнете с ядрото: базовата система е създадена да се адаптира, но добавянето на целеви хардуерни надстройки е мястото, където виждате незабавни печалби. Най-честите искания за надграждане, които получавам, попадат в три категории хардуер: оптичен, контрол на околната среда и обработка на проби. За оптични надстройки това обикновено означава коригиране на способността на системата да улавя повече детайли, без да прекъсва живите клетки. Повечето базови настройки на системата за изобразяване на живи клетки се доставят със стандартни лещи на обектива, но смяната на обективи за потапяне във вода с дълго работно разстояние (LWD) променя играта при работа с дебели проби като органоиди или сфероиди. Тези лещи имат по-дълъг цилиндър, който ви позволява да фокусирате по-дълбоко в подобни на тъкани структури, без да компресирате или увреждате клетките, което е критично при изучаване на 3D култури, които се държат много различно от плоските монослоеве. За изследователи, фокусирани върху работа с голямо увеличение – като проследяване на динамиката на единичен протеин в прилепнали клетки – добавянето на маслен имерсионен обектив с висока числова апертура (NA) намалява разсейването на светлината и създава по-резки изображения, въпреки че трябва да го сдвоите със стабилен етап, за да избегнете дрейф.
След това има осветление, често пренебрегван хардуерен ъпгрейд, който пряко влияе върху здравето на клетките. Основните живи клетъчни системи използват стандартни халогенни или LED крушки, но преминаването към регулируем източник на светлина (като лазерна линия или високоскоростен LED панел) ви позволява да регулирате дължините на вълните на възбуждане с нанометрова точност. Например, ако проследявате два флуоресцентни протеина, които са близки по спектър – да речем GFP и EGFP – регулируемият източник на светлина гарантира, че вълнувате само този, който искате, намалявайки кръстосаните смущения, които объркват вашите данни. Виждал съм също така изследователи да надграждат до конфокална единица с въртящ се диск вместо стандартна настройка с широко поле. Широкото поле може да причини фотоизбелване и фототоксичност, особено при заснемане на изображения с изтичане на времето за часове или дни; малките дупчици на въртящия се диск блокират нефокусираната светлина и намаляват общото излагане на светлина на клетките, което ви позволява да снимате по-дълго, без да променяте поведението им. Ако не сте сигурни откъде да започнете, основната система за изображения на живи клетки, свързана тук, вече е съвместима с повечето от тези оптични добавки, така че не е нужно да подменяте цялата си настройка, за да надстроите.
Контролът на околната среда не подлежи на обсъждане за живи клетки и надграждането на това често е разликата между получаването на надеждни данни и гледането на клетките да умират по време на експеримента. Основните инкубаторни камери, които контролират само температурата и CO₂, работят за кратки интервали от време, но дългосрочните изследвания - като проследяване на диференциацията на стволови клетки за една седмица или реакцията на лекарството за няколко дни - се нуждаят от по-прецизен контрол. Пълното надграждане на околната среда включва нагрята степен, която поддържа температура в рамките на 0,1°C, CO₂ и O₂ контролер за имитиране на физиологични нива на газ и монитор за влажност за предотвратяване на изпаряване на средата. За изследователи, работещи с клетки, чувствителни дори към малки промени, като първични неврони, добавянето на инкубатор от горната част на стола, който пасва директно върху стола на микроскопа, елиминира температурните градиенти, които се образуват, когато премествате проби между инкубатора и устройството за изображения. Друго надграждане тук е моторизирана сцена с пиезо z-задвижване, което ви позволява автоматично да улавяте z-стекове и да коригирате фокалната равнина за милисекунди – критично за 3D изображения или закъснения, когато клетките се движат вертикално.
Надстройките за обработка на проби са за случаите, когато трябва да изобразите повече проби или по-разнообразни проби без ръчна намеса. Много базови системи използват фиксирани държачи за проби за 96-ямкови плаки, но добавянето на моторизирано зареждане на плаки или многоямкова въртележка ви позволява да провеждате експерименти през нощта или през уикенда без изследовател на пейката. За приложения за скрининг с висока пропускателна способност (HTS), интегрирането на адаптер за манипулиране на течности, който може да добавя лекарства или среда към ямките по средата на експеримента, е огромно спестяване на време – не е нужно да поставяте експеримента на пауза, за да третирате проби, което може да наруши поведението на клетките. Ако работите с малки проби като микрофлуидни чипове или съдове със стъклено дъно, надграждането до гъвкав държач за проби, който побира персонализирани формати, е от съществено значение; много основни държачи пасват само на стандартни 96- или 384-ямкови плаки, така че това надграждане отваря вашите експерименти за нови типове анализи.
Сега другата половина от надстройките са софтуер и автоматизация и тук по-бързо превръщате необработените данни в значими резултати. Виждал съм изследователи да прекарват 10+ часа седмично в ръчно анализиране на изображения от тяхната жива клетъчна система, която е не само неефективна, но и податлива на човешка грешка. Най-голямата софтуерна надстройка, която повечето хора трябва да обмислят, е интелигентна платформа за сканиране и анализ. Нашата система за интелигентно сканиране Live Cell е създадена специално за това, но дори софтуерни инструменти на трети страни, които се интегрират с вашата основна система, могат да направят огромна разлика.
Надстройките на автоматизацията са първата стъпка тук. Вместо ръчно настройване на всеки експеримент с изтичане на времето – регулиране на фокалната равнина, дефиниране на области на интерес (ROI) и задаване на интервали от време – софтуерът за автоматизация ви позволява да програмирате целия експеримент за минути. Например, ако изучавате клетъчната миграция, можете да настроите системата да сканира само краищата на всяка ямка, където клетките растат, да пропуска празните зони и да коригира автоматично интервала от време, ако плътността на клетките се промени. Това не само съкращава времето за настройка, но също така гарантира съгласуваност между повторенията, което е ключово за публикуваните данни. Друга функция за автоматизация е проследяването на фокуса: ако клетките се движат хоризонтално или вертикално по време на експеримент, системата автоматично ще пренастройва фокалната равнина на всеки няколко секунди, така че никога да не получавате размазани изображения дори при многодневни интервали.
Надстройките на софтуера за анализ са мястото, където всъщност обработвате данните и има два основни типа, пригодени за различни експерименти. За функционални изследвания - като проследяване на калциев поток или транслокация на протеин - инструментите за анализ с един анализ, които измерват специфични параметри автоматично, са чудесни. Можете да въвеждате показатели като „преброяване на броя на клетките, които са се преместили повече от 50 микрона“ или „измерване на интензитета на флуоресценция на ядрено локализиран GFP с течение на времето“ и софтуерът ще анализира всяко изображение във вашия timelapse за минути. За по-сложни изследвания, като 3D анализи на органоиден растеж или съвместно култивиране, софтуерът за анализ, задвижван от машинно обучение, може да сегментира клетъчни популации (дори припокриващи се) и да прави разлика между различните типове клетки. Това е огромно надграждане, тъй като ръчното сегментиране на 3D изображения може да отнеме дни и е субективно – инструментите за машинно обучение се учат от вашите анотирани изображения, за да произвеждат последователни, безпристрастни резултати всеки път. Една често срещана грешка, която правят изследователите, е да се придържат към основния софтуер, който идва с тяхната система; надграждането до гъвкава платформа за анализ ви позволява да се адаптирате към нови анализи, без да изучавате нов инструмент всеки път.
Има и целеви надстройки за специализирани изследователски области, които съм виждал много по-нови изследователи да пренебрегват. За имунолозите, изучаващи взаимодействието между клетките, добавянето на модул за флуоресцентен резонансен трансфер на енергия (FRET) ви позволява да измервате молекулярните взаимодействия между две клетки, като активиране на Т клетки при свързване с антиген-представяща клетка. Това изисква източник на светлина, който може да възбуди два флуорофора наведнъж и детектор, който може да улови FRET сигнал без фонов шум. За невролозите добавянето на надграждане на изображения в близката инфрачервена област (NIR) е критично, тъй като NIR светлината прониква по-дълбоко в тъканите и причинява по-малко фототоксичност от видимата светлина, така че можете да изобразявате мозъчни срезове или in vivo животински модели за по-дълги периоди. За изследователите на стволови клетки, добавянето на фазов контрастен модул с автоматично регулиране на контраста ви позволява да изобразявате клетки без флуоресцентни етикети, което избягва промяна на поведението на клетките и намалява фототоксичността. Тези специализирани надстройки не са за всяка лаборатория, но ако работата ви се фокусира върху конкретна област, те превръщат обща система за изображения на живи клетки в инструмент, създаден за вашите точни експерименти.
Много изследователи ме питат дали ъпгрейдите си заслужават разходите и краткият отговор е: през повечето време, да - особено ако използвате системата си 10+ часа седмично. Виждал съм как една лаборатория надгражда основната си система с конфокален въртящ се диск и софтуер за автоматизация и те преминаха от провеждане на 2 малки експеримента седмично до 10, с качество на данните, което беше по-добро от системата от по-висок клас, която обмисляха да купят. Важно е обаче да планирате надстройките предварително; някои лаборатории чакат, докато основната им система остарее, но постепенното добавяне на надстройки (вместо да се подменя цялата система на всеки няколко години) е по-рентабилно. Например, ако започнете с базова система, добавите надстройка за контрол на околната среда след 6 месеца, след това добавите софтуер за автоматизация след една година, разпределяте разходите, докато подобрявате експериментите си стъпка по стъпка.
Друг ключов момент е съвместимостта: не всички надстройки работят с всяка система, така че е важно да се консултирате с вашия доставчик. Когато говоря с изследователи, които разглеждат надстройки, винаги ги съветвам първо да изброят настоящите си болезнени точки и бъдещи планове. Ако планирате да правите HTS през следващата година, дайте приоритет на автоматизацията и обработката на проби с множество ямки. Ако преминавате към 3D култура, дайте приоритет на оптичните и екологичните надстройки. Нашата система за изображения на живи клетки е проектирана да работи с повечето често срещани надстройки, така че не е нужно да се притеснявате, че частите не пасват една към друга.
В края на деня най-добрите надстройки са тези, които решават вашите специфични предизвикателства. Независимо дали сте научен учен, уморен от ръчно анализиране на изображения с изтичане на времето, изследовател на лекарства, който трябва да проведе повече HTS анализи, или биолог по развитието, изучаващ растежа на органоидите, има надстройка, която ще направи работата ви по-лесна и данните ви по-надеждни. Ако сте любопитни какви надстройки биха паснали на текущата ви настройка за изображения на живи клетки или ако искате да изградите система от нулата, не се колебайте да се свържете с нас, за да обсъдите вашите нужди.
препратки:
- Международно дружество за усъвършенстване на цитометрията. (2022). Най-добри практики за изображения на живи клетки: Намаляване на фототоксичността и фотоизбелването.Цитометрия, част А, 101 (8), 623–635.
- Zhang, Y., et al. (2021 г.). Хардуерни и софтуерни надстройки до системи за изображения на живи клетки за високопроизводителен анализ на една клетка.Journal of Biomolecular Screening, 26 (7), 541–552.
- Wang, L., et al. (2020 г.). Системи за контрол на околната среда за дългосрочно изобразяване на живи клетки: Ключови съображения за физиологично значими експерименти.Напредъкът на биотехнологиите, 40, 107562.
- Европейска лаборатория по молекулярна биология. (2023). Инструменти за автоматизация и изкуствен интелект за анализ на изображения на живи клетки: Ръководство за изследователи.Природни методи, 20 (5), 678–689.
