Като доставчик на системи за клетъчни изображения често ме питат за възможностите и ограниченията на тези усъвършенствани инструменти. Въпреки че системите за клетъчни изображения направиха революция в областта на науките за живота, предоставяйки на изследователите безценна информация за клетъчната структура и функция, важно е да се разбере, че те не са лишени от своите ограничения. В тази публикация в блога ще проуча някои от ключовите ограничения на системите за клетъчни изображения и ще обсъдя как тези фактори могат да повлияят на резултатите от изследването.
Ограничения на резолюцията
Едно от най-фундаменталните ограничения на системите за клетъчни изображения е разделителната способност на изображенията, които създават. Разделителната способност се отнася до способността на микроскопа да прави разлика между два близко разположени обекта като отделни обекти. В клетъчните изображения високата разделителна способност е от решаващо значение за визуализиране на фини детайли на клетъчните структури, като органели, протеини и нуклеинови киселини.
Разделителната способност на системата за изображения се определя от няколко фактора, включително дължината на вълната на използваната светлина, числовата апертура на лещата на обектива и качеството на детектора за изображения. В оптичната микроскопия дифракционната граница, описана за първи път от Ернст Абе през 1873 г., определя теоретична граница на разделителната способност на светлинен микроскоп. Съгласно закона на Абе минималното разрешимо разстояние (d) между два обекта се дава по формулата:
h hh th
където λ е дължината на вълната на светлината, а NA е цифровата апертура на лещата на обектива. За видимата светлина, която има обхват на дължина на вълната от приблизително 400 - 700 nm, границата на дифракция ограничава разделителната способност на светлинния микроскоп до около 200 nm странично и 500 - 700 nm аксиално.
Това означава, че характеристики, по-малки от границата на дифракция, не могат да бъдат разрешени като отделни единици в конвенционален светлинен микроскоп. Например, много субклетъчни структури, като рибозоми (20 - 30 nm в диаметър) и някои протеинови комплекси, са под границата на дифракция и не могат да бъдат визуализирани ясно с помощта на стандартни техники за оптична микроскопия.
За да преодолеят границата на дифракцията, изследователите са разработили техники за микроскопия със супер разделителна способност, като микроскопия със стимулирано изчерпване на емисиите (STED), микроскопия със структурирано осветяване (SIM) и микроскопия за локализиране на една молекула (SMLM). Тези техники могат да постигнат разделителна способност до няколко нанометра, което позволява на изследователите да визуализират клетъчните структури на молекулярно ниво. Техниките за микроскопия със супер разделителна способност обаче често са по-сложни, скъпи и отнемат време от конвенционалните методи за микроскопия и може да изискват специализирана подготовка на пробите и условия за изобразяване.
Фототоксичност и фотоизбелване
Друго значително ограничение на системите за клетъчно изображение е фототоксичността и фотоизбелването, които могат да възникнат, когато клетките са изложени на високи нива на светлина по време на изображения. Фототоксичността се отнася до увреждането, причинено на клетките от светлина, което може да доведе до промени в клетъчното поведение, метаболизъм и жизнеспособност. Фотоизбелването, от друга страна, е необратима загуба на интензитет на флуоресценция на флуорофор поради абсорбцията на светлина, което може да ограничи продължителността и качеството на флуоресцентното изображение.
Степента на фототоксичност и фотоизбелване зависи от няколко фактора, включително интензитета и продължителността на излагане на светлина, дължината на вълната на светлината, вида на използвания флуорофор и чувствителността на клетките към светлина. При изображения на живи клетки, където клетките се изобразяват за продължителни периоди от време, фототоксичността и фотоизбелването могат да бъдат особено проблематични, тъй като те могат да попречат на нормалните клетъчни процеси и да повлияят на точността на експерименталните резултати.
За да сведат до минимум фототоксичността и фотоизбелването, изследователите могат да използват няколко стратегии, като намаляване на интензитета на светлината, съкращаване на времето на експозиция, използване на източници на светлина с по-ниска енергия и избор на по-фотостабилни флуорофори. Освен това използването на усъвършенствани техники за изобразяване, като конфокална микроскопия и двуфотонна микроскопия, може да помогне за намаляване на фототоксичността и фотоизбелването чрез селективно осветяване само на интересуващата ни фокална равнина и използване на светлина с по-дълга дължина на вълната, която е по-малко вредна за клетките.
Ограничена дълбочина на рязкост и проникване
Системите за клетъчни изображения също имат ограничения по отношение на дълбочината на полето и проникването на техниката за изображения. Дълбочината на рязкост се отнася до диапазона от разстояния по оптичната ос, върху които даден обект остава на фокус. При микроскопията плитката дълбочина на рязкост може да затрудни изобразяването на дебели проби, като тъкани или цели организми, тъй като само тънък участък от пробата ще бъде на фокус във всеки един момент.
Дълбочината на проникване на техника за изобразяване се отнася до максималната дълбочина в образец, който може да бъде изобразен с достатъчна разделителна способност и контраст. При оптичната микроскопия дълбочината на проникване е ограничена от разсейването и абсорбцията на светлината, което може да доведе до замъгляване на изображението и загуба на контраст, докато светлината преминава по-дълбоко в образеца.
Например при конфокална микроскопия, която използва дупка за отхвърляне на нефокусирана светлина и подобряване на разделителната способност на изображението, дълбочината на проникване обикновено е ограничена до няколкостотин микрометра в биологични тъкани. При многофотонна микроскопия, която използва светлина с по-дълга дължина на вълната и нелинейни оптични ефекти за възбуждане на флуорофорите, дълбочината на проникване може да бъде увеличена до няколкостотин микрометра или дори милиметри, в зависимост от типа тъкан и дължината на вълната на използваната светлина.
Въпреки това, дори с усъвършенствани техники за изобразяване, дълбочината на проникване все още е ограничена и изобразяването дълбоко в дебели образци остава предизвикателство. За да преодолеят това ограничение, изследователите могат да използват техники като изчистване на тъкани, което включва третиране на пробата с химикали, за да стане прозрачна, или оптична кохерентна томография (OCT), която използва интерферометрия с ниска кохерентност за изобразяване на вътрешната структура на тъканите с висока разделителна способност и проникване в дълбочина.
Подготовка на пробата и съвместимост
Качеството на клетъчното изобразяване също силно зависи от подготовката на пробата и съвместимостта със системата за изобразяване. Правилната подготовка на пробата е от съществено значение за получаване на висококачествени изображения, тъй като може да повлияе на видимостта, контраста и разделителната способност на интересуващите ни клетъчни структури.
Подготовката на пробите обаче може да бъде сложен и отнемащ време процес и може да изисква специализирани умения и оборудване. Например при флуоресцентна микроскопия пробата трябва да бъде маркирана с флуоресцентни багрила или протеини, за да се визуализират специфични клетъчни компоненти. Процесът на маркиране може да бъде предизвикателство, тъй като изисква внимателен избор на подходящия флуорофор, оптимизиране на условията на маркиране и избягване на неспецифично свързване и фонова флуоресценция.
В допълнение, някои техники за изобразяване може да изискват специфични протоколи за подготовка на пробата, като фиксиране, вграждане или разделяне на пробата, което може да въведе артефакти и да промени естествената структура и функция на клетките. Освен това не всички типове клетки и образци са съвместими с всички системи и техники за изображения. Например, някои клетки може да са чувствителни към химикалите, използвани при подготовката на пробата или условията за изобразяване, и може да не оцелеят или да запазят нормалното си поведение по време на процеса на изобразяване.
Цена и сложност
И накрая, системите за клетъчни изображения могат да бъдат скъпи и сложни за работа, което може да ограничи тяхната достъпност и използване в изследователски лаборатории. Цената на системата за изобразяване на клетки може да варира в широки граници в зависимост от вида на микроскопа, възможностите за изобразяване и допълнителните функции и аксесоари. Например, основен светлинен микроскоп може да струва няколко хиляди долара, докато висок клас конфокален микроскоп или микроскоп със супер разделителна способност може да струва стотици хиляди долари или повече.
В допълнение към първоначалните разходи за закупуване има и текущи разходи, свързани с поддръжката, калибрирането и работата на системата за изображения, като например разходите за консумативи, софтуерни лицензи и техническа поддръжка. Освен това работата със система за клетъчни изображения изисква специализирано обучение и опит, тъй като потребителят трябва да е запознат с принципите на микроскопията, техниките за изобразяване и софтуера, използван за получаване и анализ на изображенията.
Въпреки тези ограничения, системите за клетъчни изображения остават основен инструмент в областта на науките за живота, предоставяйки на изследователите ценна информация за клетъчната структура и функция. Като разбират ограниченията на тези системи и използват подходящи стратегии за преодоляването им, изследователите могат да оптимизират своите експерименти с изображения и да получат висококачествени данни.
Ако се интересувате да научите повече за нашитеСистема за изображения на живи клеткиилиИнтелигентна сканираща система Live Cell, или ако имате някакви въпроси относно ограниченията на системите за клетъчни изображения и как да ги преодолеете, моля не се колебайте да се свържете с нас. Щастливи сме да обсъдим вашите нужди от изследвания и да ви предоставим най-добрите решения за вашите експерименти с изображения.
Референции
- Паули, JB (ред.). (2006). Наръчник по биологична конфокална микроскопия. Springer Science & Business Media.
- По дяволите, SW (2009). Оптична наноскопия в далечно поле. Наука, 325 (5944), 1144 - 1148.
- Webb, RH (2003). Въведение в конфокалната флуоресцентна микроскопия. Световен научен.
- Zipfel, WR, Williams, RM, & Webb, WW (2003). Нелинейна магия: многофотонна микроскопия в бионауките. Биотехнология на природата, 21 (11), 1369 - 1377.
